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“上调2倍”里的陷阱：bulk RNA-seq为什么需要绝对定量
发布时间：
2026-09-29
做bulk RNA-seq，我们习惯说“某基因上调了2倍”。但很少有人追问一句：这2倍，是相对于什么的2倍？
nCounts、FPKM、TPM都是“占比”，不是“个数”。占比数据的总和是恒定的——一个转录本的占比升上去，其余所有转录本的占比就必须降下来，哪怕它们在细胞里的真实分子数一个都没变。这个默认前提一旦不成立，我们看到的“上调”和“下调”，可能只是归一化造出来的算术结果。
所以这篇文章想聊三件事：相对定量为什么会出错，四组已发表的证据从北海浮游生物的周年观测到衣原体感染早期的全局转录激活；现有的绝对定量手段各能做到哪一步、边界又在哪；以及美格基因在这条路上的下一步——从已上线的宏基因组（绝对定量）、宏转录组（绝对定量），推进到真核转录组与原核转录组，两款绝对定量新品目前处于内测阶段。
一、一个被默认接受的前提
做bulk RNA-seq，我们拿到的第一份结果通常是nCounts、FPKM或TPM。这些数字有一个共同点：它们是“占比”，不是“个数”。TPM的定义决定了每个样本的TPM之和恒为一百万。这意味着数据是闭合的（compositional）——某一个转录本占比上升，其余所有转录本的占比必然被动下降，哪怕它们在细胞里的绝对分子数一个都没变。
图1. 绝对定量VS相对定量
在绝大多数实验里，这不是问题，因为我们默认接受了一个前提：样本之间总RNA量大致恒定，多数基因的表达不发生改变。问题在于，这个前提经常不成立。下面的证据大多来自微生物组与宏转录组研究。但闭合数据的数学性质与物种无关——只要拿到的是“占比”，同样的失真就会发生在单一物种的bulk RNA-seq上。
二、前提不成立时，会发生什么
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证据一：相对表达与实测细胞数不相关，绝对表达相关
2025年《The ISME Journal》的一篇观点文章，用北海微真核浮游生物的周年数据做了一个很干净的比较：
图2. 分类组成的每月生物量波动和周转率
图3. 硅藻TPM和TPL与FlowCam-derived硅藻计数的比较
同一批样本、同一份测序数据，只是换了一种定量方式，结论就从“显著”变成“不显著”。
文章还给出一个具体案例：4月硅藻的TPM下降，真实原因不是硅藻变少了，而是定鞭藻Phaeocystis globosa短暂爆发、主导了RNA池，把硅藻的“占比”压了下去。冬季光合作用活性更典型——TPM看上去全年恒定，绝对表达显示冬季几乎为零。
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证据二：归一化假设能造出几百个“假下调”
2024年《BMC Genomics》的一项研究分析了衣原体感染早期的转录组。这个体系存在全局性转录激活——几乎所有基因都在上调。
那300个“下调”基因，是归一化假设硬造出来的。
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证据三：改变的是结论，不只是数字
2017年《Nature》上的定量微生物组分析研究把相对丰度乘以实测微生物载量后，肠道群落变异与疾病表型之间的关联发生了实质性改变。
图4. 相对微生物组分析 vs. 定量微生物组分析，研究队列参与者（n=40）的属水平粪便微生物组组成。
图5. 克罗恩病中的定量微生物组变化，采用相对或定量微生物组分析方法，对一组克罗恩病患者队列中的微生物群变化进行研究。
2018年《Microbiome》的研究在土壤样本中报告了同一件事：某些类群的相对丰度下降，但绝对丰度保持稳定甚至上升——这种变化在相对丰度数据里被完全掩盖了。
图6. Bawburgh与 Wytham土壤中的原核与真核群落结构，a-d依次为原核生物16S rRNA基因相对丰度、绝对丰度，真核生物18S rRNA基因相对丰度、绝对丰度
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证据四：那个默认前提，本身就被质疑
2019年《PLoS Computational Biology》的文章说得直接：高通量转录组分析普遍依赖“多数基因不变、细胞总 RNA 恒定”这一假设，而越来越多独立研究表明该假设经常被违反。作者用外源 spike-in 建立了完整的校准模型，把测序读数换算成每个细胞内 RNA 分子的绝对丰度，并在酿酒酵母与海鞘分化细胞系中完成验证。
三、什么时候最危险
并不是每个实验都需要绝对定量。以下几类场景下，相对定量出错的概率显著更高：
图7. 相对定量出错的概率显著更高的几类场景
一句话：只要你的实验会影响“总量”，相对定量就会失真。
四、目前有哪些绝对定量的手段
已有方案大致可以分成四类。它们的差别不在精度，而在在哪一步引入标准。
图8. 常见四类绝对定量方案
真正的绝对丰度，必须按细胞数、样本体积或单位质量进行标定。这是方法学上的分水岭，也是评价任何绝对定量方案时第一个该问的问题。
五、美格基因的绝对定量路线
我们在这条路上已经走了一段：
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MetaTrue-Quant™宏基因组（绝对定量）——已上线。回答“谁在、有多少”；
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MetaTrue-Quant™-RNA宏转录组（绝对定量）——已上线。回答“谁在表达、表达了多少”。
两者采用的都是内标法：在样本中掺入已知拷贝数的外源内标，测序后按内标的实际回收率换算，把相对占比还原为绝对拷贝数。
接下来，我们要把同一套双内标体系、双阶段校正，从宏转录组（绝对定量）推进到常规的真核转录组和原核转录组。目前这两款转录组（绝对定量）产品已进入内测阶段，正式的实验流程、分析内容与交付标准将在内测完成后公布并上线，即将与大家见面。
六、结尾
从“上调了多少倍”到“从 N 个分子变成 M 个分子”，这一步看起来只是换了个单位。
但它决定了你的数据能不能跨批次放在一起、能不能和蛋白与代谢的绝对量对上、能不能在半年后还被别人复用。
我们会持续在这个方向投入。感兴趣的同仁，欢迎保持关注，也欢迎就你的物种与场景与我们交流。
参考文献：
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