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颠覆认知：TPM靠不住？宏转录组（绝对定量）才是微生物群落的“真实之眼”
发布时间：
2026-06-05
在微生物群落研究中，TPM是最常用的基因表达标准化方法，但它能否真实反映生态系统的动态变化？《ISME》上发表的一篇观点文章，利用北海浮游生物一整年的数据告诉我们：TPM可能正在误导你的结论，而绝对定量（如TPL）才是揭示种群动态的关键。今天，我们就来了解这篇文章，看看为什么TPM可能会得出完全相反的生态结论，以及如何用绝对定量技术，真正看清微生物世界的动态变化。
英文标题：A case for absolute gene expression estimates in microbiome studies using metatranscriptomics
中文标题：利用宏转录组学在微生物组研究中估计绝对基因表达的案例
作者：Michiel Perneel等
期刊/IF：ISME（10.0）
发表时间：2025.08.22
DOI：https://doi.org/10.1093/ismejo/wraf188
宏转录组学被广泛用于研究微生物群落在其自然环境中的功能动态。微生物群落中基因表达的变化可以大致分为两类：一类是由于细胞或生物体对各种发育信号和环境刺激的反应而产生的变化；另一类则是由种群动态和分类单元的变化所引起的变化。在这方面，作者认为，要准确理解种群动态对基因表达模式的影响，就需要确定各基因的绝对表达量，这样才能弥补现有研究中主要使用的相对表达指标的不足。作者以一项关于北海南部地区微真核表面浮游生物代谢活动及物种更替的季变化的研究为例进行说明。
相对表达量在微生物宏转录组学研究中的应用与局限性
RNA-Seq的read数量受测序深度、转录本长度、GC含量等多种因素影响，因此需要通过归一化处理实现样本内或样本间的可比性。其中TPM标准化法先按转录本长度校正读数，再将每个样本的读数总和调整为100万，因可比性强、操作简便，被广泛用于聚类、降维和可视化分析。然而TPM属于相对表达量，常被错误地当作绝对表达的代理，其前提是假设各样本总mRNA含量大致相同；但在实际中，不同组织或条件下的总mRNA含量可能存在显著差异（如热休克导致mRNA水平大幅下降），这会干扰差异表达基因的准确检测。尤其在微生物转录组学中，样品间的微生物密度、生物量、代谢活性及环境条件变化会导致总mRNA含量差异普遍存在，而TPM无法反映这些绝对变化，因此不适合捕捉动态生态系统中转录本丰度的绝对变化，也不应被滥用为绝对表达量的替代指标。
研究微生物种群动态的绝对表达量
为了克服TPM等相对表达量在微生物生态系统研究中的局限，研究者提出了TPL（每升转录本）等绝对测量方法，其核心是向样本中添加内部RNA标准品（如ERCC Spike-In混合物），可在RNA提取前或提取后加入，前者更优但需已知RNA产量，后者则无法校正提取过程中的损失。绝对表达水平的计算分两步：先计算标准品和目标转录本的TPM值，再通过转换因子将TPM转换为TPL，从而支持样本间绝对表达值的直接比较。不过，TPL同样存在偏差，包括文库制备效应、标准品比例偏离、RNA提取效率差异、过滤效率及RNA降解等因素，因此在解释结果时需保持谨慎。早期因样本处理技术变异性大，相对测量更为稳妥；而随着近年来RNA提取与处理流程可重复性的显著提高，对大量样本进行可靠的绝对表达谱测定已变得切实可行。
案例研究：使用相对与绝对表达量来研究北海南部的种群动态
近期，对北海南湾微真核浮游生物开展了一项为期一年的基于宏转录组学的调查，旨在阐明TPM等相对表达量在分析微生物群落功能时间动态时的局限性。方法上，每月从不同站点采集50 L海水，过滤获取50–250 μm粒径的生物组分，提取RNA后加入ERCC Spike-In混合物，进行mRNA测序。将读段比对至基于全年数据从头组装的参考宏转录组，使用Kallisto估算各样本的TPM值。同时利用ERCC估算绝对表达水平（TPL），综合考虑了过滤体积、样品处理体积及RNA用量。由于ERCC在RNA提取后添加，TPL估计值未校正样本间RNA提取效率的差异。
TPM与TPL描绘了北海南部微生物季节性动态的两种不同图景（图1）。基于TPM的分析显示，9至12月硅藻转录本的相对表达较8月显著上升，暗示其生态重要性增强；但TPL与FlowCam数据表明，该上升伴随硅藻及其他微真核生物绝对丰度的大幅下降，得出截然相反的结论。类似地，TPM显示4月硅藻丰度或活性低于2月或5月，实则因球形棕囊藻（定鞭藻）爆发主导了RNA池，稀释了硅藻的相对比例。这些案例凸显TPM的关键缺陷：样本内标准化使一类群丰度或活性的上升会人为压低所有其他类群的TPM值，从而误导对种群动态的解释。相比之下，TPL与FlowCam计数的线性关联更为显著（图2），证明绝对表达量能更真实地反映生物丰度变化。尽管在生物量及群落组成波动较小的系统中TPM与TPL差异可能不如本研究显著，但TPM作为绝对表达替代指标的局限性在多数微生物生态研究中依然存在。需注意，TPL与FlowCam计数并非完全吻合，部分原因在于自动成像分类器会将非代谢活性的硅藻壳计入计数；从这一角度看，TPL有时甚至比FlowCam更能准确反映活体生物丰度。
图1. 分类组成的每月生物量波动和周转率
图2. 硅藻TPM和TPL与FlowCam衍生硅藻的比较
TPL不仅在反映微生物组组成方面优于TPM，在揭示分子过程的动态变化方面也同样更准确地捕捉了季节性趋势（图3）。以硅藻的光合作用为例，基于TPM的表达曲线显示其光合活动全年保持相对稳定；而TPL曲线则呈现出预期中的模式：冬季几乎无光合活动，夏季出现明显的活性高峰。TPM与TPL曲线之间的差异，源于秋冬季硅藻的相对丰度较高，导致其TPM值被相应放大（图1）。在许多特定代谢过程（如脂肪酸生物合成）的硅藻TPM曲线中，这一效应导致秋冬季出现显著上升，而在对应的TPL曲线中该趋势则消失（图3B、3F）。若将特定代谢过程的TPM曲线以每月总硅藻TPM水平进行标准化，该偏差基本消除，但曲线的生物学解释也随之改变。例如，光合作用的原始TPM曲线反映的是硅藻光合转录活性在样本总转录活性中的相对占比；TPL曲线呈现的是绝对光合转录活性；而经总硅藻TPM标准化后的曲线则代表光合作用在硅藻总转录投资中的相对比例，即硅藻在光合作用上的相对转录投入。由此可见，TPL与标准化后的TPM值传达了不同层面的信息。总体而言，TPL估计能够支持在不同时空尺度间比较微生物群落的基因表达水平，并能更真实地反映绝对生物丰度。
图3. 不同表达指标下硅藻代谢的时间动态
结论和建议
尽管TPM目前是宏转录组学研究中量化基因表达的事实上的标准，但它不太适合动态微生物生态系统的时空监测。作为基于样本内归一化的相对表达度量，TPM不能充分捕捉样本间有机体或转录本丰度的绝对变化，这使得它不适合解释群体规模和代谢活动的自然波动——在比较特定基因、代谢特征或微生物群落跨空间和时间的分类组成时，这种限制仍然存在。尽管TPM值的分类单元特异性归一化可以解决由其他分类单元的可变存在或活动引起的相对表达偏差，从而提供跨样本分类单元的相对转录投资的更准确视图，但分类单元归一化TPM值仍然是相对表达测量，不考虑感兴趣分类单元的绝对丰度或转录活性的变化。
绝对表达测量，如TPL，尽管有其自身的局限性，更适合样本之间的比较，并且可以提供与从相对表达分析中获得的知识互补的生态学见解。因此，作者主张在分析复杂微生物生态系统的宏转录组时使用内部RNA标准。这些内部标准不仅允许比较时空数据集中样本之间的绝对表达水平，而且还可以促进数据集之间的比较，并提高作者将基因表达谱与生物地球化学测量相结合的能力，这对于获得对自然环境中微生物群落动态和功能的综合理解至关重要。
结语
科学从来不怕推翻旧认知，怕的是用错了工具还在坚信结论。
TPM 是一项伟大的发明，但它不是为了解决微生物群落的种群动态问题而设计的。
本文作者用北海浮游生物一整年的翔实数据，向整个微生物组学界发出了一个清晰的信号：是时候重新审视我们使用TPM的方式了。过去由于技术限制，我们不得不在相对表达的灰色地带中摸索；如今，内参标准化和绝对定量已经成为成熟、可及、成本可控的技术选项。定量技术的进一步完善，将为全面理解自然环境中微生物群落的动态与功能提供关键技术支撑。
一个研究领域的进步，往往不是来自更复杂的算法，而是来自更诚实的测量。绝对定量并不能让实验变得更简单，但它能让结论变得更可靠。
常规定量宏转录组技术优势与不足
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优势 |
不足 |
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（1）更准确地反映生态动态。 （2）支持跨样本、跨数据集的直接比较。 （3）与生态学和生物地球化学测量结果更好地关联。 （4）补充相对表达信息。 |
（1）技术偏差与不确定性： -标准品添加的局限性 -流程依赖的稳健性 （2）实验操作更复杂，成本增加： -实验设计：需要精心设计和优化标准品的添加策略与浓度。 -样本处理：需要在实验全程精确记录体积和操作步骤，增加了操作复杂性。 -数据分析：需要额外的计算步骤来推导转换因子。 （3）依赖于参考或高质量组装 |
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