微生物多样性_绝对定量_扩增子测序_技术优势

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微生物多样性（绝对定量）

产品介绍

常规扩增子测序技术虽然具有高通量、低成本、可客观还原菌群结构及相对丰度比例的优势。但目前大部分的扩增子测序技术仅产生相对丰度的数据，会导致统计分析中的高假阳性率和相关分析偏差，无法体现样本中物种的真实数量，也无法衡量组间样本的真实微生物群落的绝对丰度差异。因此，通过添加序列、拷贝数已知的内标DNA和高通量测序结合的扩增子绝对定量测序技术可以矫正扩增子测序偏差，较为精准地确定微生物种群丰度，增加样品间可比性，进一步真实反映样本中物种的真实数量和组间样本的真实差异，使测序结果更为准确可信。
基于常规扩增子测序技术的偏差及局限性，我们设计了12段特定的外源内标DNA，其中包含原核生物及真核生物的通用引物结合位点，且经过Blast方法验证与已知自然物种序列无匹配。将已知浓度和拷贝数的外源内标DNA梯度添加至环境样本DNA中，混合后进行扩增并对扩增子进行测序；在PCR反应过程中，内标质粒会扩增产生与16S-V3V4或ITS2片段大小接近的扩增产物：测序输出OTU中计算内标DNA和环境样本中各菌群的绝对丰度，建立梯度内标DNA拷贝数（log copies）和测序序列数（log reads）间的线性回归方程并用于样本OTU和reads数据矫正，最终得到样本群落组成及其绝对丰度信息。

技术参数

产品	测序策略	检测片段	数据量
微生物多样性（绝对定量）	NovaSeq PE250	16S-V3V4、ITS2-1	12 w raw reads

产品优势

更准确的生物量估计：绝对定量测序能够提供每个分类单元的具体拷贝数，从而更准确地反映样本中的生物量。
增强数据的可比性：由于绝对定量测序提供了具体数值而非比例，这使得不同实验室之间、不同时间点收集的数据更容易进行直接比较，增强了研究结果的通用性和可靠性。
减少技术偏倚：在常规扩增子测序过程中，PCR扩增效率差异可能会导致某些微生物被高估或低估，影响最终结果的准确性。通过引入内部标准品或使用其他校正方法，绝对定量测序可以在一定程度上消除这种偏差，提高结果的真实度。
更深入地理解生态系统动态：绝对定量数据有助于更准确地分析微生物群落在不同条件下的变化趋势，例如疾病进展、环境变化等因素对微生物组成的影响，这对于理解复杂的生态系统功能至关重要。
优化实验设计：利用绝对定量信息，研究者可以更有效地设计实验，比如确定样本大小、评估干预措施的效果等，从而提高研究的整体效率和成本效益。
同时实现绝对+相对定量分析：同时进行相对定量和绝对定量分析，一次测序两份结果。

技术比较

技术方法	应用方面	测序速度	优点	缺点
qPCR	样本多	慢	方法成熟敏感性高	需要荧光试剂对引物要求高跨平台系统误差
流式细胞术	样本多直接计数	快	操作时间短能灵敏检测细胞状态	仪器昂贵适用于小型细胞鉴定水平低
常规扩增子	样本多	快	检测速度快	只能相对定量高假阳性率和相关分析偏差
spike-in 内标法	样本多	快	高灵敏度易于处理与高通量测序方法结合，检测速度快	精细实验操作要求高实验及数据分析成本更高

技术路线

分析流程

案例解析

案例一：

英文标题：High-throughput absolute quantification sequencing reveals the adaptive succession and assembly pattern of plastisphere communities in municipal sewer systems: Influence of environmental factors and microplastic polymer types
中文标题：高通量绝对定量测序揭示了市政污水系统中浮游生物群落的适应性演替和组装模式：环境因素和微塑料聚合物类型的影响
期刊：Environmental Pollution
发表时间：2024-02-01
样品类型：污水、沉积物
链接：https://doi.org/10.1016/j.envpol.2023.123136

城市下水道系统因微塑料的巨大库存量及其潜在的生态影响而受到越来越多的关注，但对于塑料圈（plastisphere）这一负面影响方面知之甚少。通过采用16S rRNA基因扩增子绝对定量高通量测序技术结合现场调查和实验室测试，研究揭示了塑料圈支持丰度微生物定植的能力，并探讨了环境和聚合物因素对其演替和组装的影响，发现微塑料能显著增加微生物定植，但形成的塑料圈中群落多样性较低。研究还指出，外源底物流量和组成是塑料圈群落生长和演替的关键，高氮基线促进了塑料圈内特定细菌的生态位形成，且有氧条件下的微生物定植负荷更高，交互模式也更密集。此外，不同聚合物如聚乙烯与聚丙烯对塑料圈多样性的影响存在差异。这些发现增进了对微塑料如何影响下水道微生物生态及可能增加的健康风险的理解。

案例二：

英文标题：High-throughput absolute quantification sequencing reveals the effect of different fertilizer applications on bacterial community in a tomato cultivated coastal saline soil
中文标题：高通量绝对定量测序揭示了不同肥料施用对沿海盐碱地种植番茄的细菌群落的影响
期刊：Science of The Total Environment
发表时间：2019-10-15
样品类型：土壤
链接：https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.06.105

沿海盐土是一种具有高农业利用潜力的重要土地资源储备。本研究采用高通量绝对定量16S rRNA测序方法，探究了四种不同施肥方案（即100%生物有机肥、70%生物有机肥+30%化学肥料、30%生物有机肥+70%化学肥料、100%化学肥料）对番茄种植盐土中细菌群落组装的影响。田间试验结果显示，70%生物有机肥加30%化学肥料组合是最优剂量，有利于提高该沿海潮汐区番茄的产量和果实品质。盆栽试验同样表明，70%生物有机肥加30%化学肥料的应用对促进番茄生长和激活土壤微生物群落最为有效。施肥提供的营养物质使细菌总丰度增加了3倍以上，同时导致土壤细菌多样性显著下降。Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes等主要门类在微生物群落变化中起主导作用，特别是在70%生物有机肥处理和100%化学肥料处理的土壤中表现尤为明显。冗余分析和Pearson相关性分析表明，尽管有机质含量和土壤pH值在微生物群落组装中发挥了重要作用，但土壤养分可利用性，尤其是有效磷和钾，以及土壤盐度是塑造该生态系统中细菌群落的关键环境因素。

案例三：

英文标题：High-Throughput Absolute Quantification Sequencing Reveals that a Combination of Leguminous Shrubs Is Effective in Driving Soil Bacterial Diversity During the Process of Desertification Reversal

中文标题：高通量绝对定量测序揭示，在荒漠化逆转过程中，豆科灌木的组合有效地促进了土壤细菌多样性。

期刊：Microbial Ecology

发表时间：2022-12-10

样品类型：土壤

链接：https://doi.org/10.1007/s00248-022-02151-0

图5 基于不同沙子固定灌木组合中土壤细菌丰富菌门的欧几里得距离的热图和层次聚类图

沙漠化严重影响了沙漠地区生态系统的功能，种植耐旱植物特别是豆科灌木成为逆转沙漠化的有效手段。本研究通过高通量绝对定量16S rRNA测序，分析了中国毛乌素沙地南部固定沙丘上三种豆科灌木组合（C. korshinskii × Corethrodendron scoparium、C. korshinskii × Calligonum mongolicum、C. scoparium × C. mongolicum）对土壤细菌多样性的影响，发现C. korshinskii × Corethrodendron scoparium组合下的土壤细菌Shannon指数显著高于其他两种组合，且某些细菌门类如放线菌门、变形菌门等的丰富度显著增加，表明特定豆科灌木组合能够促进土壤微生物多样性和生态系统恢复。此外，通过冗余分析和结构方程模型进一步揭示了土壤理化性质对土壤细菌组成和多样性的影响。

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